Sanger sequencing # Find similar titles
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Table of ContentsSanger sequencing은 1977년에 Frederick Sanger에 의해 개발된 방법으로, 기본적으로 polymerase chain reaction (PCR) 과정에서 di-deoxynucleotide triphosphates (ddNTPs)에 의해 DNA strand가 합성되지 않는 chain termination의 원리와, 전기영동의 원리를 이용하여 염기서열을 확인하는 방법이다. Sanger sequencing 원리 #Sanger sequencing을 이해하기 위해서는 우선적으로 PCR 과정 대해 이해할 필요가 있다. DNA 서열 증폭을 위해서는 DNA를 구성하는 기본 단위인 deoxynucleotide triphosphate (dNTP)가 필요하다. DNA 서열에 dNTP가 중합될 때, DNA 서열 마지막 nucleotide 3번 탄소의 수산화기(-OH)와 새로운 dNTP 5번 탄소의 인산기가 반응하여 결합된다. Sanger sequencing 원리의 핵심은 ddNTPs에 있다. ddNTP는 dNTP의 3번 탄소에 산소(oxygen)이 존재하지 않는, 즉 수산화기(-OH) 대신 수소(-H)가 결합되어 있는 nucleotide 구조이다. Fig1. ddNTP 구조 그림출처 : http://www.bio.davidson.edu/courses/molbio/molstudents/01licohen/sequencing.html Sanger sequencing을 진행할 때는 dNTP에 추가적으로 소량의 ddNTP가 포함된 PCR을 우선 진행한다. 이 때, 4 가지의 ddNTP (핵산별로 ddATP (아데닌), ddGTP (구아닌), ddTTP (티민), ddCTP (사이토신))는 서로 다른 형광물질로 염색되어 있다. PCR 과정에서 DNA가 증폭되던 중 우연히 dNTP 대신 ddNTP가 결합된 경우, ddNTP의 3번 탄소에는 수산화기가 없으므로 더 이상 새로운 인산기가 결합될 수 없어 증폭이 중지된다 (chain termination). ddNTP의 결합은 무작위적으로 일어나게 되므로, 수 많은 증폭과정을 통해 거의 모든 염기서열 위치에서 chain termination이 일어나게 된다. 1차적으로 ddNTP를 포함한 PCR이 완료된 후에는, 염기서열을 크기에 따라 작은 순서대로 정렬할 수 있는 전기영동을 이용하여 증폭된 서열을 정렬한다. 크기순으로 정렬된 서열의 순서대로 형광 신호를 인식시키면, 염기서열 순서대로 해당 염기 서열에 해당하는 핵산 정보가 각 서열 끝에 마지막으로 결합된 ddNTP가 가지고 있던 형광물질 종류에 따라 읽히게 된다. Fig2. Sanger sequencing 원리 그림출처 : http://dwb.unl.edu/Teacher/NSF/C08/C08Links/www.piopio.school.nz/molmed.htm Incoming Links #Related Bioinformaticses (Bioinformatics 0) #
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DNA Sequencing is the process of reading nucleotide bases in a DNA molecule. Unlock the genome and answer biology’s most challenging questions with our innovative and accessible sequencing solutions. For over 25 years, our sequencers have contributed to significant scientific breakthroughs, including sequencing of the first human genome and the discovery of genes implicated in diseases like cystic fibrosis. Our ongoing innovation in sequencing technologies continues to drive new discoveries. From whole genome sequencing to targeted sequencing of specific genomic regions, our sequencing portfolio supports a wide range of throughput and research application needs for DNA sequencing. Sanger sequecing
일반적인 template DNA의 염기서열 분석3'-ATGACTGAGC-5'와 같은 template DNA 서열 분석에서는
Sanger Sequencing 기본 원리dNTP + 소량의 dd{A,C,G,T}TP (ddNTP)를 섞어주게 되면, DNA polymerase가 template DNA에 상보적인 서열을 합성해 나가다가, 중간중간에 ddNTP가 끼어 들어간 DNA 분자가 합성되게 된다. 그러한 분자는 더 이상 길어지지 않고 합성이 중단되게 된다. 이들 ddNTP에는 각각을 구별할 수 있는 형광물질이 결합되어 있기에, 새로이 합성된 DNA 들의 마지막 염기 종류에 따라 서로 다른 형광을 띄게 된다. 여기에서 주목할 것은, 합성된 DNA 분자들은 모든 자리에서 4개 중의 어느 하나의 ddNTP가 끼어 들어간 것이기에, 정확히 한 염기씩 길이의 차이가 나는 것들이다. 이들은 전기영동법에 의해 크기 순으로 나열할 수 있으며, 레이저 빛을 각 전기영동 밴드에 쬐면, 형광물질에 따라 특이적인 파장의 빛을 발하게 되며, 이를 순서대로 읽으면 원래 염기서열(3'-ATGACTGAGC-5')과 상보적인 5'-TACTGACTCG-3'을 얻게 된다. 
ddNTP와 dNTP의 차이(과제)
미국 인간게놈 연구소에서 만든 애니메이션 - How to Sequence a Genome - part 6, 7, 8, 9 (강추!)https://www.genome.gov/25019885/ https://www.genome.gov/edkit/flash/section6.html https://www.genome.gov/edkit/flash/section7.html https://www.genome.gov/edkit/flash/section8.html https://www.genome.gov/edkit/flash/section9.html
Base call quality score위의 560base 전기영동 결과 중 색이나 peark가 겹친 부분이 있다. 이것을 확률적으로 나타내는 것을 base call quality
score라고 한다. 1% 이상의 error가 연속적으로 나타난다면 잘라내서 버리는 작업을 Trimming이라고 하며, 생거 시퀀싱을 한번 할 경우 560base 중 500base 정도가 남는다고 한다.
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Dna sequencing 방법
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